Gun들지마의 Bioinformatics 생명정보학

최근 생명정보학에 관심있으신 고등학생들을 대상으로 진행한 과학영재캠프에서 발표한 내용입니다.

GSEA란 Gene Set Enrichment Analysis의 줄임말로 특정 유전자들의 집합이 있으면 이 유전자들이 어떠한 특성을 가지는 지 알아보는 분석 방법입니다. RNA 시퀀싱의 downstream analysis로 많이 쓰입니다.
간단하게 GSEA를 하는 방법은, 내가 원하는 Gene들을 p-value로든 Fold change로든 어떠한 점수를 기준으로 1위부터 꼴등까지 줄을 세웁니다. 그 후에 그 순위를 가지고 어떠어떠한 Gene Set에는 높은 순위의 유전자가 많이 들어있더라, 낮은 순위의 유전자가 많이 들어있더라 등을 확인합니다. 여기서 Gene set은 특정 pathway에 속하는 유전자들일 수도 있고, 공통된 기능을 가진 유전자 그룹일 수도 있고, 특정 질병에 노출되면 발현되는 유전자 리스트일 수도 있습니다. 사용자가 정하기 나름이죠.
Broad Institute와 UC San Diego에서 이러한 유전자 세트, Gene set을 데이터베이스화 해서 정리해놓은 사이트가 있는데 그게 MsigDB입니다. 인간과 쥐의 유전자를 그룹별로 잘 정리해놓아서, GSEA에 유용하게 쓸 수 있습니다.
https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/

GSEA는 보통 그룹 간의 DEG (Differentially Expressed Gene), 즉 유의미하게 다르게 발현된 유전자들을 가지고 실행할 수가 있습니다. 이 때에 실행하는 GSEA는 내가 뽑은 DEG들이 어떠한 성격을 지니고 있는지 알아보는 것이겠죠. 예를 들어서, 두 환자 그룹에 한 그룹에는 비타민D를 1개월간 복용시키고 다른 그룹에는 플라시보를 복용시켜서 유전자 발현의 차이를 보는 경우에 두 그룹 간의 DEG를 구해 GSEA를 돌려 본다면 비타민D로 인하여 유의미하게 변한 유전자가 대체로 어떠한 그룹에 속하며 어떤 기능을 가지고 있는 지 알아볼 수 있습니다. 이 때, 이 DEG가 10개-20개 정도면 뭐 하나하나 살펴볼 수 있겠지만, 100개에서 500개 이렇게 나온다면 하나하나 보는 건 너무 많은 시간과 노력이 들겠죠. 그러면 GSEA가 이러한 시간을 아주 줄여줄 수 있습니다.
비슷하지만 다른 방법의 GSEA로는, DEG만 넣는 게 아니라 모든 유전자의 발현 정보를 넣어서 GSEA를 실행해볼 수도 있습니다. 이 때에는 입력 값이 아주 크겠지만, 위의 예제로 본다면 비타민D가 전반적으로 어떠한 영향을 미치고 어떤 pathway가 변화하는 지 종합적으로 알 수가 있습니다.
위의 두 방법 중에 어느 것이 옳고 어느 것이 틀리고 그러지는 않습니다. 다만, 내가 알아보려고 하는 질문에 따라서 전자 혹은 후자를 택하기도 합니다.
이 글에서는 Single cell RNA-Seq 분석을 할 때에 그 Downstream analysis로 Seurat 객체를 가지고 GSEA를 하는 방법을 간단히 기록하려고 합니다.

일단 먼저 Seurat을 불러오고 내가 이용하려는 데이터를 불러옵니다. 또한, 우리가 하려는 GSEA는 모든 유전자를 줄세워서 입력하는 위에 적은 후자의 방법을 쓰기 때문에, 유전자를 그룹 간에 비교한 값이 필요합니다. Seurat으로는 2만개 이상의 유전자를 모두 비교하는 데 엄청나게 오래 걸리기 때문에, presto 패키지에 있는 Wilcoxon rank sum test를 불러와서 사용하려고 합니다.

library(Seurat)
library(devtools)
install_github("immunogenomics/presto")   #인스톨을 최초로 한 다음에는 이 줄은 생략합니다
library(presto)

#또 나중에 필요한 라이브러리 들을 여럿 불러와 보겠습니다.
library(msigdbr)
library(fgsea)
library(tidyr)
library(dplyr)
library(ggplot2)
library(tibble)
library(tidyverse)
library(data.table)

그런 다음, Wilcoxon rank sum test를 모든 유전자 대상으로 수행해줍니다. 제 Seurat 데이터는 myData3에 저장되어 있으며 저는 그 중 celltype.condition에서 특정 세포 (CD14+ Monocytes)의 질병 그룹(cALD)과 건강한 비교군 (Control) 간의 차이를 보고 싶습니다.

DefaultAssay(myData3)<-"RNA"
Idents(myData3)<-"celltype.condition"
myData.genes<-wilcoxauc(myData3, "celltype.condition", 
				groups_use = c("CD14+ Mono_cALD","CD14+ Mono_Control"))

이제 앞서 말한 mSigDB에서 Gene Set들을 불러와야 합니다. 저는 가장 기본으로 유전자를 50개의 질병 및 생명 현상으로 나눈 Hallmark gene sets를 먼저 보려고 합니다. 그리고 이 불러온 Gene Set을 GSEA에 필요한 정보만 뽑아서 정리해 줍니다.

#msigdbr_show_species() 
#위의 코드는 모든 가능한 생물 종을 표시해 줍니다.

#"H"로  Hallmark gene set을 불러 옵니다.
m_df<- msigdbr(species = "Homo sapiens", category = "H") 
#불러온 Gene Set을 정리해 줍니다.
fgsea_sets<- m_df %>% split(x = .$gene_symbol, f = .$gs_name)

#불러온 Gene Set을 살펴봅니다.
head(m_df)
dplyr::count(myData.genes, group)

그런 다음에 제가 원하는 그룹을 뽑아서 logFC와 AUC score를 빼낸 뒤 정리해봅니다. 저는 CD14+ Mono_cALD 그룹에서 어떠한 pathway들이 더 혹은 덜 발현되는지 알아보고 싶습니다.

myData.genes %>%
  dplyr::filter(group == "CD14+ Mono_Control") %>%
  arrange(desc(logFC), desc(auc)) %>%
  head(n = 10)

#그리고 뽑은 정보들을 auc에 따라 1등부터 꼴등까지 줄을 세워봅니다.
CD14Mono.genes<- myData.genes %>%
  dplyr::filter(group == "CD14+ Mono_Control") %>%
  arrange(desc(auc)) %>% 
  dplyr::select(feature, auc)

ranks<- deframe(CD14Mono.genes)
head(ranks)

이제 실제로 GSEA를 실행합니다. 저희는 이번에 fgsea라는 패키지를 사용할 겁니다. 바이오컨덕터로 간편하게 설치 가능합니다.
https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/fgsea.html

fgsea는 인풋으로
1) 미리 지정한 Gene Set 이 필요하구요 (m_df로 불러들여서 fgsea_sets로 포맷을 맞춤)
2) 유전자의 리스트와 각각 유전자의 순위 혹은 순위를 지정할 수 있는 점수가 필요합니다 (myData3에서 auc를 계산하여 myData.genes에 저장, 그런 다음 CD14Mono.genes에 순서대로 저장)

fgseaRes<- fgsea(fgsea_sets, stats = ranks, nperm = 1000)
fgseaResTidy <- fgseaRes %>%
  as_tibble() %>%
  arrange(desc(NES))

#결과를 출력하기 좋게 정리합니다
fgseaResTidy %>% 
  dplyr::select(-leadingEdge, -ES, -nMoreExtreme) %>% 
  arrange(padj) %>% 
  head()

이제 마지막 순서입니다. ggplot을 이용하여 결과를 나타내어 봅니다.

ggplot(fgseaResTidy %>% filter(padj < 0.05) %>% head(n= 50), aes(reorder(pathway, NES), NES)) +
  geom_col(aes(fill= NES<0)) +
  coord_flip() +
  labs(x="Pathway", y="Normalized Enrichment Score",
       title="Hallmark pathways NES from GSEA") + 
  theme_minimal()

다음과 같은 결과가 나옵니다.

각각 Pathway나 Gene Set에 Enrichment Plot을 보려면 다음 코드가 유용합니다.

plotEnrichment(fgsea_sets[["HALLMARK_TNFA_SIGNALING_VIA_NFKB"]],
               ranks) + labs(title="HALLMARK_TNFA_SIGNALING_VIA_NFKB")

 
참 쉽죠??
끝!!!

Seurat tutorial에서 제공하는 코드입니다. 이 코드를 실행시키면, 각각의 클러스터에서 다른 세포들보다 과발현된 유전자들을 정리해줍니다. 저는 주로 이 결과를 csv로 정리해서 엑셀로 열어본 다음 여러가지 데이터베이스에 넣어보기도 하고, 논문을 찾아보기도 합니다.

​

주로 찾아보는 데이터베이스:

a. PanglaoDB: 싱글셀 데이터가 방대하게 모아져있으며 유전자를 넣으면 그 유전자가 어느 세포에서 얼마나 발현되는지 알려줍니다.

https://panglaodb.se/index.html

그리고 각 세포 종류마다 마커들을 모아놓은 페이지도 있습니다. 한가지 단점은 유전자를 하나하나 찾아보고 정리해야 한다는게 번거로울 때가 있습니다.

​

b. Single Cell Portal: 싱글셀 데이터를 모아 놓은 Broad Institute의 데이터베이스입니다.

https://singlecell.broadinstitute.org/single_cell

Biocompare라는 사이트인데 거기서 올린 글에 유용한 정보가 많이 있을 때가 있습니다. 위의 링크는 NK 세포의 subtype에 관한 글이고 그 외에 T cells, B cells 에 관련한 글도 이 사이트에 있어서 도움이 많이 되었습니다.

​

2. SingleR

싱글알은 많은 연구자들이 쓰시는 Annotation 도구입니다. Bioconductor로 설치 가능하며, Seurat 오브젝트와 직접적인 호환은 되지 않지만, SingleCellExperiment로 변환하여서 간편히 실행할 수 있습니다.

https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/SingleR.html

#scRNASeq 분석을 진행하던 도중에 UMAP을 보니 데이터에 #Doublet 이 제법 많이 있다는 사실을 알게 되었습니다. #UMAP 에서 보면 서로 다른 클러스터 사이에 브릿지같은 연결 다리가 보이죠? 그게 서로 다른 두 종류의 세포가 같은 방울 안에 묶여서 같이 시퀀싱 된 더블렛이라고 볼 수 있습니다.

이렇게 데이터 상에서 더블렛이 나타나는 경우에 다음 단계의 분석에 영향을 미칠 수도 있고, 클러스터링이 어려울 수가 있습니다. 그래서 #Seurat 에서는 기본적으로 feature number 혹은 gene number 등에 범위를 줘서 어느정도 doublet을 거르고 있습니다.

하지만 데이터의 성격이나 품질에 따라서 이러한 스크리닝으로도 더블렛이 제거가 안되는 경우가 있습니다. 그럴 때에 따로 Doublet 을 찾아내는 프로그램을 사용하게 됩니다. 이러한 프로그램에는 여러가지가 있지만 저는 그 중에 #DoubletFinder 라는 프로그램을 선택해서 사용하였습니다. 이 소프트웨어를 쓴 이유는:

1. 사용 설명이 비교적 자세하고 친절하게 되어있음 (그렇지 않은 프로그램들이 참 많죠 ㅠㅠ)
2. 비교적 최근까지 업데이트가 이루어짐
3. Seurat 파이프라인과 연계가 간편함 (대부분의 다른 프로그램들은 SingleCellExperiment 스트럭쳐로 옮긴 다음에 실행을 해야해서, 데이터 구조를 변화를 시켜서 실행시킨 다음, 결과가 나온 후에 다시 Seurat 파이프라인으로 옮기는 과정이 들어가야 합니다.)
4. 우리 학교 사람이 만들었어요.

이 소프트웨어는 아래의 링크에서 무료로 구하실 수 있습니다. R 패키지로 설치도 가능하구요.

https://github.com/chris-mcginnis-ucsf/DoubletFinder

DoubletFinder에 관한 배경이나 설명, 알고리즘은 위의 웹페이지에 자세하게 설명이 되어 있으니 넘어가고 실질적으로 사용하는 과정만 기록하겠습니다.

1. 일단 Seurat package를 불러들입니다. 만약 샘플끼리 이미 Integration을 했다면, 더블렛을 제거하고 다시 Integrate를 하는 것을 권장합니다. 아래의 R 코드는 Cellranger에서 count를 마치고난 결과를 읽어들여서 Seurat object로 만드는 것부터 시작합니다.

library(dplyr)
library(patchwork)
library(DoubletFinder)

#메모리를 많이 잡아먹을 수 있기 때문에 사용 메모리를 늘려줍니다
options(future.globals.maxSize = 8000 * 1024^2)

#파일을 불러옵니다
raw.data<-Read10X(data.dir="./p10v3/filtered_feature_bc_matrix/")

#Seurat object를 만듭니다
myData<-CreateSeuratObject(counts=raw.data, project = "myData", min.cells = 3, min.features = 200)

#다음 두줄은 나중에 합쳐서 분석을 위해 정보를 추가했습니다
myData$patient<-"p10"
myData$visit<-"v3"

#익숙한 방법으로 mt 유전자들을 마크하고 걸러냅니다. 이때, Seurat 기본 튜토리얼에서는 5% 이상은 걸러내라고 적혀있는데, 실제 나중에 나온 실험 논문을 찾아보면 이 수치가 종마다, 조직마다 다르니까 찾아보시는 게 좋습니다
myData[["percent.mt"]]<-PercentageFeatureSet(myData, pattern = "^MT-")
VlnPlot(myData,features=c("nFeature_RNA","nCount_RNA","percent.mt"),ncol=3)
myData<-subset(myData,subset=nFeature_RNA > 200 & nFeature_RNA<4500 & percent.mt<15)

2. 그런 다음에 이제 노멀하게 PCA 및 UMAP 등을 돌려서 프로세싱해줍니다.

#기본 Seurat 파이프라인입니다. PCA dimension이나 Cluster resolution 등은 샘플에 맞게 알아서 조절해주세요. 기본으로 쓰셔도 무방합니다.
myData<-NormalizeData(myData)
myData <- FindVariableFeatures(myData, selection.method = "vst", nfeatures = 2000)
all.genes <- row.names(myData)
myData<-ScaleData(myData, features = all.genes)
myData<-RunPCA(myData)
myData<-RunUMAP(myData, dims = 1:30)
myData<-FindNeighbors(myData, reduction = "pca", dims = 1:30)
myData<-FindClusters(myData, resolution = 0.55)

3. 이제 DoubletFinder 홈페이지에 있는 직접 실행시키는 예제가 나오는데요. 변수 이름은 굳이 바꾸지 않았습니다.

sweep.res.list_myData<-paramSweep_v3(myData, PCs = 1:30, sct = FALSE)
sweep.stats_myData<-summarizeSweep(sweep.res.list_myData, GT = FALSE)
bcmvn_myData<-find.pK(sweep.stats_myData)

#이 시점에서 그래프가 나옵니다. pK를 계산해주는 그래프인데, 그래프만으로는 최대값 지점을 한눈에 알기가 어려우므로 다음 줄을 실행시킵니다
bcmvn_myData

4. 이전 단계에서 pK 최대값 지점을 확인한 후에 다음 코드를 실행시킵니다. 여기서 붉은색 숫자는 샘플 안에 Doublet이 얼마나 들어있는지를 예측하는 퍼센트입니다. 이 수치는 시퀀싱 테크닉마다 다르고, 샘플 내의 세포 갯수에 따라 또 다릅니다. 저의 경우에는 10X를 이용했는데 10X Genomics 홈페이지에 다음과 같이 퍼센트가 나와있습니다. 자신 샘플의 세포 갯수에 따라 조절해주세요.

homotypic.prop <- modelHomotypic(myData@meta.data$nFeature_SCT)
nExp_poi<-round(0.085*nrow(myData@meta.data))
nExp_poi.adj <- round(nExp_poi*(1-homotypic.prop))

5. 이제 실제로 Doublet을 구해봅시다. 아까 찾은 pK를 붉은색 숫자에 알맞게 넣어줍니다. 저희의 경우는 0.005였죠.

myData <- doubletFinder_v3(myData, PCs = 1:30, pN = 0.25, pK = 0.005, nExp = nExp_poi, reuse.pANN = FALSE, sct = FALSE)

#위의 코드를 실행하고 나면, myData의 구조를 다음 코드로 확인해봅니다
head(myData[[]])

#그 후에 아래의 pANN_0.25_0.005_763 을 자신의 데이터에 맞는 이름으로 고쳐주면 됩니다
myData <- doubletFinder_v3(myData, PCs = 1:30, pN = 0.25, pK = 0.005, nExp = nExp_poi.adj, reuse.pANN = "pANN_0.25_0.005_763", sct = FALSE)
head(myData[[]])

#그리고, DimPlot을 만들어 Doublet과 Singlet을 관찰해 봅시다 물론 DF.classifications 뒤에 오는 숫자는 알맞게 고쳐줘야합니다DimPlot(myData, group.by = "DF.classifications_0.25_0.005_763", raster = FALSE)

6. 이제 실제로 Doublet이 몇개인지 Singlet이 몇개인지 전체는 몇개인지 알아봅시다. 이런 수치들은 그때그때 적어서 기록으로 남겨두는 편입니다

length(myData@meta.data$DF.classifications_0.25_0.005_763)
length(myData@meta.data$DF.classifications_0.25_0.005_763[myData@meta.data$DF.classifications_0.25_0.005_763=="Singlet"])
length(myData@meta.data$DF.classifications_0.25_0.005_763[myData@meta.data$DF.classifications_0.25_0.005_763=="Doublet"])

7. 마지막으로 Singlet만 골라서 rds 형식으로 저장합니다.

myData_sub<-subset(myData, subset = DF.classifications_0.25_0.005_763 == "Singlet")
saveRDS(myData_sub, file = "DoubletRemoved/p10v3.rds")

DoubletFinder를 이용하여 더블렛을 제거하고 다시 저장하는 방법을 알아보았습니다.

끝