학교에서 첫학기랑 둘째학기랑 Student Seminar라고 그주에 초대 강연하시는 분의 페이퍼 하나씩을 골라서 돌아가면서 프리젠테이션을 하고 있습니다.
담당교수님께서 이분야에서는 정말 인정받으시는 분이긴 한데 그만큼 깐깐하신 분이라 완벽하게 준비를 해가야지 아니면 된통 혼이나기도 한답니다.
그래서 이번주의 페이퍼는 제목그대로 인데요, 그런데 첫번째 저자가 무려 한국사람!!!
뭐 그분 볼일은 없겠지만 참 반갑네요.
아, 원문 링크는 요기 입니다
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19706440
제목 그대로를 번역하면 감염된 콩팥 상피 세포에서 미생물이 분출한다는 군요....엥 뭔 분출?
좀 더 자세히 알아보기로하죠.
Introduction
미국 여성중에 10~20%는 방광염/요도염으로 병원을 방문한다고 하는데요. 이렇게 만연한 병이지만, 사실 요도점막은 다른점막에 비해서 그 방어시스템이 잘 구축되어있는 편이라고 합니다.
하지만 Uropathogenic Escherichia coli (UPEC) 는 특이하게도 이런 방어시스템을 돌파하는데 성공적이랍니다 (85%이상)
그 이유는 이 UPEC가 요도점막 표면을 관통해서 부착되는 능력에 있답니다.
또한 다른 스터디에서는 이 UPEC가 intracellular bacterial communities를 cytoplasm에서 형성한다고 합니다.
E. coli가 bladder epithelial cells (BEC)에 침투할때는 caveolin 1이나 Rac1같은 lipid raft를 이용한답니다.
특히 최근에는, E. coli가 세포내로 들어간 후에 특수한 exocytic vesicles (fusiform vesicles)에 번식을 하는게 발견되었습니다.
이 vesicles는 방광이 팽창할때 필수적인 역할을 합니다.
그리고 세포안에서 증식하던 박테리아들은 조금씩 조금씩 세포밖으로 빠져나갑니다.
이 페이퍼에서는 그러한 메커니즘을 설명하는게 될려나요?
Results
1. 이전의 연구결과에서 감염된 BEC는 계속적으로 UPEC를 배출한다는게 밝혀졌습니다. 그래서 이 현상이 E. coli에만 국한 적인건지, 만약에 그렇다면 어떤 과정으로 되는지 알아보는군요.
이 현상이 E.coli에만 국한되는건지 알아보기 위해서 4개의 다른 박테리아를 가지고 Gentamicin Protection Assay를 했답니다. (Gentamicin Protection Assay에 대한 설명은 요기 )
요길 보시면 앞에 둘은 E. coli구요 뒤에 둘은 다른 박테리아인데, 24시간 후에 E.coli의 양이 현저히 줄어드는걸 볼 수 있습니다.
이 현상은 박테리아가 세포에서 탈출한 걸로 볼 수 있지만, 세포내에 있는 박테리아가 죽어버린 걸로 해석할 수도 있는데요. 그래서 다음 실험은 박테리아가 과연 죽은건지, 아니면 세포에서 나간건지를 실험했습니다.
이걸 알아보기위해
BEC를 E.coli ORN103에 한시간 동안 푹 담근다음, gentamicin으로 바깥에 있는 박테리아를 다 죽였습니다. 그리고 이때의 세포내의 박테리아 양과 4시간후에 박테리아양을 비교했군요. 이 4시간 사이에는 bacteriostatic agent로 박테리아 증식을 막았구요. 그랬더니 처음에 세포내에 있던 박테리아의 양과 4시간후에 세포 안과 밖에 있는 박테리아의 양이 같았습니다. 그러므로 E.coli가 세포안에서 차례차례 조금씩 바깥으로 나가는걸 확인할 수가 있었죠.
꼼꼼하게도 이분들은 위의 실험이 immortalized human BEC에서 행해졌다고, 실제로 human primary BECs에서도 실험을 한 결과 비슷한 결론을 내릴수 있었습니다. 이렇게 꼼꼼하시니깐 PNAS에 실렸겠죠. 그리고 박테리아가 빠져나가는 걸 비디오클립으로도 보실수 있습니다.
다음으로 이분들이 왜 다른 박테리아는 아닌데 E.coli만 이런식으로 exocytosis가 일어나는가의 이유를 E.coli가 특별하게 붙는 fusiform compartments에서 찾았답니다. 이 fusiform compartments는 cAMP에 의해 exocytosis가 일어나는데요, 만약에 이분들의 가정이 맞다면, E.coli의 exocytosis도 cAMP와 관련이 있겠죠?
그래서 intracellular cAMP 레벨과 extracellular E.coli레벨을 비교했더니 확실히 둘다 같이 증가하는 모습을 보였습니다. 반대로 RNAi를 통해서 cAMP 생성을 막아보았더니 E.coli의 exocytosis가 줄어드는것을 볼 수 있었습니다.
이제 E.coli의 배출을 위해서 어떠한 것들이 연관이 있나 알아보기 위해서 LPS가 cAMP랑 연관해 박테리아의 분출을 촉발시키는지 알아보았습니다.
여기서 E.coli에 감염된 BEC를 ultra purified LPS와 섞어보았습니다. 아래에서 보시다시피 cAMP레벨이 증가할 수록 E.coli의 양도 많아지는군요!
그 다음에 여기서 Toll-Like Receptor (TLR)4 가 어떤식으로 관련이 되어있는지를 보기위해서 RNAi로 TLR4의 mRNA양을 줄여 보았습니다. 그러니 당연히 bacterial expulsion의 양도 줄어 듭니다. 그러므로 Bacterial Expulsion은 줄여서 말하면, LPS에의해 시작되어서 TLR4가 중간역할을 해서 이루어 지는군요.
좀 더 자세히 알아본 결과, fusiform vesicle의 marker인 Rab27b과 lipid microdomain의 한 부분인 Caveolin-1도 같이 짝지어서 감연되지않은 BEC와 함께 bacterial exocytosis에 역할을 담당한다고 합니다.
TLR4/cAMP 와 Rab27b/Caveolin-1 complex의 연관성을 알아보기위해 알려진 MyRIP이라는 scaffolding protein에 대해서 좀더 조사해보았습니다. 여기서는 pull-down assay를 썼는데요. pull-down assay에 대한 설명은 여기에!
그 결과 MyRIP는 중간에서 연결하는 역할을 해주는군요.
음... 이분들 께서 이 과정을 요약해서 그림으로 잘 설명해주시고 있네요.
Discussion
이 연구를 통해서 E.coli expulsion에 대해서 체계적으로 알수 있었습니다.
이 expulsion 매커니즘에서 MyRIP이 담당하는 역할과, Rab27b 및 Caveolin1의 관련성을 알 수 있구요. 이걸 통해서 여성들에게 빈번한 요도염/방광염을 치료하는 계기가 마련되었으면 좋겠네요.
처음 블로그 글을 올리는 거라 두서도 없고 마지막 부분에서는 너무 간략히 대강대강 하는 관계로 뭔가 이상하네요. 해외에 오래있다보니 한글로 글쓰는것도 서툴고 배워야할 점이 정말 많네요.
일단 이 글의 요지는 여기 원본에 나와계신 연구자 분들의 연구결과 및 페이퍼를 정리하는거라 모든 글의 저작권은 원작자분들에게 있음을 알려드립니다.
